摘要：在醫(yī)學(xué)真菌學(xué)研究領(lǐng)域，明確病原真菌的致病性是理解其發(fā)病機(jī)制、評(píng)估治療策略及開發(fā)新藥的核心。利用動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)，被視為驗(yàn)證真菌致病性的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本方案旨在闡述如何系統(tǒng)性地建立并評(píng)估真菌動(dòng)物感染模型，其中霉菌培養(yǎng)箱在關(guān)鍵步驟中扮演著的角色，用于量化真菌負(fù)荷與評(píng)估感染進(jìn)程。

一、 研究目標(biāo)與核心思路

本研究旨在通過標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物感染模型，評(píng)估目標(biāo)真菌菌株（如臨床分離株、基因敲除/過表達(dá)株）的體內(nèi)致病能力強(qiáng)弱。核心思路是：將真菌以特定方式接種于易感動(dòng)物，隨后通過一系列終點(diǎn)指標(biāo)（生存率、組織載菌量、病理?yè)p傷），客觀、定量地比較不同菌株的毒力差異。整個(gè)過程高度依賴于霉菌培養(yǎng)箱對(duì)回收真菌的準(zhǔn)確培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。

二、 動(dòng)物感染模型的建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：

常用模型：小鼠是泛使用的模型動(dòng)物。根據(jù)研究目的，可選擇免疫正常的野生型小鼠，或免疫缺陷小鼠（如中性粒細(xì)胞減少癥模型、Cyclophosphamide處理小鼠），后者對(duì)條件致病真菌（如曲霉、念珠菌）更為敏感，能模擬免疫功能低下宿主的嚴(yán)重感染。

感染方式與途徑：

全身播散性感染模型：通過尾靜脈注射一定濃度的真菌孢子或酵母細(xì)胞懸液。此模型用于研究真菌的全身性定植、擴(kuò)散能力及對(duì)抗真菌藥物的全身療效。

侵襲性肺曲霉病模型：通過鼻腔吸入或氣管內(nèi)接種孢子懸液。這是研究見侵襲性真菌病——侵襲性肺曲霉病的經(jīng)典模型。

皮膚或皮下感染模型：在剃毛皮膚表面涂抹或進(jìn)行皮下注射，用于研究皮膚癬菌或皮下真菌病的致病過程。

三、 致病性評(píng)估的核心指標(biāo)與方法

感染模型建立后，需通過以下多維度的指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估：

生存率分析：最直接、力的終點(diǎn)指標(biāo)。

方法：設(shè)立對(duì)照組（如PBS注射）與實(shí)驗(yàn)組（接種不同菌株），每日觀察并記錄動(dòng)物的生存狀態(tài)。

數(shù)據(jù)分析：繪制Kaplan-Meier生存曲線，使用Log-rank檢驗(yàn)比較不同組間的生存率差異。生存期顯著縮短的組別，其感染菌株的毒力更強(qiáng)。

組織器官真菌載量定量分析：關(guān)鍵量化指標(biāo)，依賴霉菌培養(yǎng)箱完成。

方法：在感染后設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)（如24h, 48h, 72h, 7天）處死動(dòng)物，無(wú)菌采集目標(biāo)器官（肺、肝、脾、腎、腦等）。

勻漿與培養(yǎng)：將組織稱重后加入無(wú)菌PBS進(jìn)行勻漿。取適量勻漿液進(jìn)行系列稀釋，涂布于選擇性固體培養(yǎng)基（如含氯霉素的SDA平板）上。

霉菌培養(yǎng)箱的作用：將涂布后的平板置于霉菌培養(yǎng)箱中，在適宜真菌生長(zhǎng)的溫度（通常25-30℃或37℃，視菌種而定）下培養(yǎng)24-72小時(shí)。

結(jié)果判定：計(jì)數(shù)平板上的菌落形成單位，并根據(jù)稀釋倍數(shù)和器官重量，計(jì)算每克組織中的CFU數(shù)量。載菌量越高，表明真菌在該組織中的增殖和定植能力越強(qiáng)。

組織病理學(xué)分析：直觀顯示真菌-宿主相互作用的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。

方法：取部分組織用福爾馬林固定，石蠟包埋后切片。

特殊染色：采用過碘酸希夫染色（PAS）或六胺銀染色（GMS），這些染色能特異性地將真菌細(xì)胞壁染成紅色或黑褐色，使其在組織背景下清晰可見。

鏡下觀察：在光學(xué)顯微鏡下評(píng)估：

真菌侵襲程度：菌絲/孢子在組織中的分布范圍、深度。

菌絲形態(tài)：觀察體內(nèi)菌絲形態(tài)是否與體外培養(yǎng)一致。

宿主反應(yīng)：炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)類型（中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）、組織壞死、肉芽腫形成等病理變化。

四、 霉菌培養(yǎng)箱在本研究中的核心價(jià)值

在整個(gè)研究鏈條中，霉菌培養(yǎng)箱并非僅是一個(gè)培養(yǎng)工具，而是實(shí)現(xiàn)定量化、標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估的基石：

精準(zhǔn)定量：通過提供穩(wěn)定、均一的培養(yǎng)環(huán)境，確保從組織中回收的真菌能夠可靠地形成可見菌落，使得CFU計(jì)數(shù)準(zhǔn)確可靠，這是比較不同菌株或不同處理組間毒力差異的客觀數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

標(biāo)準(zhǔn)化操作：所有組織樣本在相同的培養(yǎng)條件下處理，避免了因培養(yǎng)條件波動(dòng)引入的誤差，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性與可比性。

結(jié)論：綜合利用動(dòng)物模型與霉菌培養(yǎng)箱等關(guān)鍵技術(shù)，建立系統(tǒng)的體內(nèi)致病性研究方案，是解析真菌毒力因子、評(píng)估新型抗真菌藥物或宿主導(dǎo)向療法效能的黃金法則。其中，霉菌培養(yǎng)箱在將“感染”這一生物學(xué)過程轉(zhuǎn)化為可精確測(cè)量的“數(shù)據(jù)”（CFU/g組織）方面，發(fā)揮著不可替代的核心作用，為真菌致病機(jī)理研究與防控策略開發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支撐。